作业帮荧光定量PCR引物设计本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/05 09:01:18
荧光定量PCR引物设计本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电
荧光定量PCR引物设计
本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电泳仅出现目的带,接着我准备用sybr green 做荧光定量PCR,不知道可不可以就用我现在设计的这个引物去做?因为目的基因是多基因家族,所以在设计引物时我是在3非翻译区设计的引物,不知道荧光定量PCR中,此引物还可不可以用?
荧光定量PCR引物设计本人在做荧光定量PCR之前,先用Primer 3.0设计了目的基因的引物,用于半定量PCR,而且也把引物放入NCBI中进行了blast比对,得到引物为特异性引物,半定量PCR效果也跟预期一样,电
完全可以,PCR长度从50bp到数百都可以,不止局限于150-300个碱基对.楼上说的有道理,但是有一点要注意,最好计算一下扩增片段的Tm值,这样做溶解曲线的时候,光有一个峰还不够,而且得到的TM和你计算的Tm相吻合才行.
是否在翻译区没有影响.
博凌科为-为你理论上讲是可行的。只要你的产物片段在150-300个碱基对左右，并且有特异性，作为荧光定量应该是没有问题的。但是这里有一点你要注意，你在做半定量的时候电泳看到单一的条带不意味着不存在非特异性扩增。事实上电泳检测DNA灵敏度是很低的，在EB染色下，在电泳上出现一个条带的前提是要有5个ng的DNA,也就是说如果你在半定量中，非特异性的产物并不是主要产物，因此低于5ng的话，你在电泳时看不...
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博凌科为-为你理论上讲是可行的。只要你的产物片段在150-300个碱基对左右，并且有特异性，作为荧光定量应该是没有问题的。但是这里有一点你要注意，你在做半定量的时候电泳看到单一的条带不意味着不存在非特异性扩增。事实上电泳检测DNA灵敏度是很低的，在EB染色下，在电泳上出现一个条带的前提是要有5个ng的DNA,也就是说如果你在半定量中，非特异性的产物并不是主要产物，因此低于5ng的话，你在电泳时看不到了。因此你在做全定量的时候一定要看终产物的熔解曲线，如果这个曲线是单一峰的话，才能说明你的引物可以完全使用。
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在real-time PCR中，一般原则是100～150bp的扩增产物最好（Livak et al., Methods 2001），能使扩增效率尽量接近100%，以保证定量的准确性。引物的Tm值最好在58～62度之间，正反引物间Tm值差距在1度以内，GC含量在40%～60%之间且两条引物GC含量接近，引物长度在21～25bp。满足这些条件的引物适宜用来荧光定量PCR。在程序跑完之后要看一下熔解曲线...
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在real-time PCR中，一般原则是100～150bp的扩增产物最好（Livak et al., Methods 2001），能使扩增效率尽量接近100%，以保证定量的准确性。引物的Tm值最好在58～62度之间，正反引物间Tm值差距在1度以内，GC含量在40%～60%之间且两条引物GC含量接近，引物长度在21～25bp。满足这些条件的引物适宜用来荧光定量PCR。在程序跑完之后要看一下熔解曲线(dR/dT)，有单一峰的说明是非特异性扩增，但要注意对于多基因家族，可能有好几个成员都能扩出同样片段大小的产物——这在半定量时是区分不开的，一是看熔解曲线，再有你也需要自己好好分析一下序列，看有没有可能扩出其他成员。嗯，以上。
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