作业帮overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/03 03:34:02
![overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg](/uploads/image/z/9474722-26-2.jpg?t=overlap+%E4%B8%80%E3%80%81%E7%94%A8%E8%BF%99%E5%AF%B9%E5%BC%95%E7%89%A9A1-F%EF%BC%9AgggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2-+R%EF%BC%9Agatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag%E6%89%A9%E5%A2%9E%E5%87%BA%E7%89%87%E6%AE%B5A%2C%E4%BA%A7%E7%89%A9%E9%95%BF2540bp%E5%B7%A6%E5%8F%B3%5Bcolor%3DRed%5D%E5%B7%B2%E5%89%B2%E8%83%B6%E5%9B%9E%E6%94%B6%2C%E5%8D%B3%E7%89%87%E6%AE%B5A%E4%BA%8C%E3%80%81%E7%94%A8%E8%BF%99%E5%AF%B9%E5%BC%95%E7%89%A9B1-+F%EF%BC%9Atcttcccggcg)
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overlap
一、用这对引物
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
A2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag
扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]
已割胶回收,即片段A
二、用这对引物
B1- F：tcttcccggcgccccaatgcgcgcaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatc
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
扩增出B片段,产物长1680bp
已割胶回收,即片段B
三、把一、二步中得到的PCR产物A、B通过overlap PCR连接起来,产物长4200bp左右
使用引物：
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
就在这一步问题出现了,就是这步做了N多次,就是PCR不出目标条带,（每一次pcr产物都会出两个杂带很亮大约一个1100bp,一个1800bp,始终无目标带）
本人使用primestar酶 采用温度梯度(50度至65度)、模板1:1浓度梯度（20ng至200ng）、同时也采用了两步法（68度5分钟或者72度5分钟退火延伸）.也使用过LATAQ酶 PfuUltra IIFusion HS DNA Polymerase 酶.都没扩增出目标条带.
也采用过体系中仅仅不加引物直接跑PCR20个循环,在加入引物在跑30个循环（也这样做过,取该体系中混合液2微升做模板,在重新做一次该PCR）结果还是没有目标条带.
以上PCR全是延伸5分钟,终延伸10分钟.具体的PCR都是按照酶的说明书操作.
本人可以说在实验过程中可以完全不用考虑因实验操作导致失败---这点可以肯定无误!
overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]已割胶回收,即片段A二、用这对引物B1- F：tcttcccggcg
亲,仔细看一下,你的B1-F的5‘端是不是多了一个t,或者A2- R的3‘端少了一个A?这两个引物不是完美overlap唉
生物实验就是这样 我都急了两个月我的实验了。。。。